RNAi 特异性抑制A20基因对H2O2诱导人脐动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

背景：锌指蛋白A20是近年来细胞内源性保护机制研究的新靶点，目前研究表明锌指蛋白A20抑制肿瘤坏死因子，脂多糖等多种炎性细胞因子诱导核因子κB信号通路激活所引起的血管平滑肌细胞增殖，但有关A20抗细胞氧化损伤方面的影响报道甚少。 目的：观察锌指蛋白A20基因干扰对H2O2诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞增殖和细胞核中核因子κB表达的影响及可能的分子生物学机制。 设计、时间及地点：随机对照实验，于2007-03/2008-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成。 材料：体外培养人脐动脉血管平滑肌细胞，构建针对Genbank中人A20的基因序列，采用脂质体LipofectamineTM2000介导80pmol siRNA，6 μL转染。 方法：将培养的第4代人脐动脉血管平滑肌细胞随机分6组，①空白组：培养基培养，未给与任何干预。②A20siRNA组：转染A20siRNA 24 h。③scramble siRNA组：转染阴性对照scramble siRNA 24 h。④H2O2组：H2O2持续刺激6 h。⑤H2O2＋A20siRNA组：转染A20siRNA 24 h后H2O2持续刺激6 h。⑥H2O2＋scramble siRNA组：转染阴性对照scramble siRNA 24 h后H2O2持续刺激6 h。 主要观察指标：以RT-PCR，Western-blotting检测A20基因表达变化，以四甲基偶氮唑蓝方法测定细胞增殖活性，以流式细胞技术观察血管平滑肌细胞细胞周期的变化，以Western-blotting检测细胞核中核因子κB p65的蛋白含量表达。 结果：H2O2组细胞增殖率明显高于空白组，但低于H2O2＋A20siRNA组(P < 0.05)。H2O2组S期、G2/M期构成百分比，增殖指数均较空白组明显升高，然而较H2O2+A20siRNA组明显降低(P < 0.05)，空白组A20mRNA与蛋白有微弱表达，A20siRNA组较空白组表达减少(P < 0.05)；H2O2组A20mRNA与蛋白表达明显高于空白组但显著低于H2O2+A20siRNA组(P < 0.05)干扰效率大约55%。细胞核中核因子κB p65有少量表达；A20siRNA干扰后核因子κB p65含量明显增加；H2O2刺激后核因子κB p65表达含量显著增加但明显低于H2O2+A20siRNA组(P < 0.05)。 结论：A20基因可抑制H2O2损伤诱导的血管平滑肌细胞的增殖，其分子机制可能通过其负反馈抑制了核因子κB介导的信号转导途径。

Effects of RNA interference-inhibited A20 gene on H2O2-induced proliferation of human umbilical artery smooth muscle cells