流式细胞术辅助筛选和纯化人缺氧诱导因子-1α基因沉默肝癌细胞株

目的利用流式细胞术（FCM）协助筛选、纯化RNA干扰（RNAi）效率高的人缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）基因沉默肝癌细胞株.方法选择带Neor及GFP基因的质粒pGenesil-1.1构建HIF-1α靶向小干扰RNA（siRNA）重组表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721.首先用G418筛选,然后用FCM检测出常氧、缺氧条件下HIF-1α蛋白表达抑制效率最高的转基因细胞株.根据FCM可分选GFP阳性细胞这一特点,进一步用流式细胞分选仪分选纯化转基因细胞,最后用PCR和免疫组化方法鉴定纯化细胞株的HIF-1α干扰效率.结果单用G418筛选HIF-1α干扰组细胞最高筛选效率为32.9%,FCM检测HIF-1α蛋白抑制率为78.7%～92.8%;合并使用G418和FCM分选纯化后,最佳HIF-1α干扰组筛选效率达94.4%,常氧、缺氧条件下对HIF-1αmRNA表达抑制率分别为95.5%、85.2%.结论合并使用G418及FCM分选纯化得到了高RNAi效率的人HIF-1α基因沉默肝癌细胞株,为进一步研究HIF-1α与肝癌关系及靶向HIF-1α的肝癌基因治疗提供了实验基础.