人低氧诱导因子1-α转染人骨髓内皮祖细胞的体外实验

目的：将人低氧诱导因子1-α（HIF1-α）转染人骨髓内皮祖细胞(EPCs)，为探讨转染HIF1-α基因的EPCs对梗塞心肌血管修复及血管再生能力提供依据。方法：密度梯度法分离人骨髓中单个核细胞，以1×10⁶•mL^-1细胞浓度接种于用纤维连接蛋白包被的培养皿中，培养14 d后采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性成分ecNOS、flk- 1的表达；采用acLDL-Dil和FITC-UEA-1对细胞染色；采用Lipofectamine^TM 2000介导PCDNA3.0-HIF1-α质粒转染EPCs， RT-PCR检测HIF1-α的转录； ELISA检测细胞上清中VEGF表达；免疫印迹法检测HIF1-α蛋白表达。结果：培养第5天起，部分圆形单核细胞转化为梭形贴壁EPCs，7 d左右出现由数十个细胞形成的细胞集落， 10 d后形成明显克隆。RT-PCR检测ecNOS在548 bp处出现条带,flk-1在819 bp处出现条带；acLDL-Dil和FITC-UEA-1双染色阳性；RT-PCR在383 bp处出现特异性条带；ELISA转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为（20.53±2.33） μg•L^-1，未转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为（3.96±1.67） μg•L^-1，两组比较差异有显著性（P<0.05）。免疫印迹法(Western blotting)检测在相对分子质量120 000处出现条带。结论：PCDNA3.0-HIF1-α质粒成功转染EPCs。