H2S 在缺血再灌注损伤中神经细胞自噬发生机制中的作用研究

目的：利用siRNA 干扰技术干扰H2S 生成的关键酶胱硫醚β- 合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）基因并构建细胞氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型，探讨OGD/R 和CBS 基因干扰后SH-SY5Y 细胞自噬和凋亡情况及相关信号通路变化。方法：构建OGD/R 模型，体外模拟缺血再灌注过程，根据氧糖剥夺和再灌注时间不同共设9 组，利用透射电镜观察各组细胞OGD/R 后细胞内自噬小体形成情况，根据透射电镜结果选取氧糖剥夺
4 h/ 再灌注24 h 作为后续实验的OGD/R 模型；脂质体转染法将针对CBS 基因的siRNA 转入SH-SY5Y 细胞内，同时构建OGD/R 模型，将细胞分为3 个组，分别为CBS 干扰组，OGD /R 组和CBS 干扰+OGD/R 组，各组均设相应对照。Real time PCR 和蛋白印迹法鉴定CBS 基因干扰效率，并检测各组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 和信号通路中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达水平，以及凋亡信号通路中NF-κBp65、COX-2 蛋白表达水平；流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。结果：透射电镜观察细胞内自噬小体：除正常对照组和氧糖剥夺4 h/ 再灌注12 h 组未观察到自噬小体外，其余各组均在胞质内观察到了较多自噬小体。CBS 基因干扰效率达80%。CBS 干扰组自噬相关蛋白及相关信号通路蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR 蛋白表达水平与阴性对照组比较均无统计学差异；OGD/R 组与正常对照组比较，OGD/R 组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 明显高于正常对照组， p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 均明显降低，NF-κBp65、COX-2 蛋白表达水平均高于正常对照组；CBS干扰+OGD/R 组与对照组比较，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR 均无显著差异。CBS 干扰组细胞凋亡率与阴性对照组比较无统计学差异；与正常对照组比较OGD/R 组细胞凋亡率明显高于正常对照组；CBS 干扰+OGD/R 组与阴性对照组比较，细胞凋亡率无显著差异。结论：OGD/R 能够明显诱导SH-SY5Y细胞发生自噬和凋亡，且可能与Akt/mTOR 及 NF-κBp65/COX-2 信号通路相关；CBS 基因干扰后对细胞自噬和凋亡均无明显影响。