plenti6.3-hHGF-IRES-hrGFP慢病毒表达载体的构建和鉴定

目的构建人肝细胞生长因子(hHGF)基因慢病毒表达载体并进行鉴定。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增IRES和hrGFP,拼接成IRES-hrGFP,并克隆到pLenti6.3载体;进一步采用PCR技术扩增hHGF,并克隆到plenti6.3-IRES-hrGFP载体,然后BamHI/AscI双酶切和测序鉴定构建的plenti6.3-hHGF-IRES-hrGFP重组载体。脂质体法转染293T细胞,24h、48h、72h后显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白表达情况和ElISA测定细胞上清液中HGF蛋白表达情况。最后利用ViraPowerTM慢病毒表达系统,将表达质粒与包装混合物(PackagingMix)共转染293T细胞产生包装病毒颗粒,以293T细胞hrGFP表达水平(荧光显微镜下对hrGFP表达阳性细胞进行计数)测定病毒滴度。结果 IRES,hrGFP和hHGF基因片段重组到plenti6.3载体,电泳结果和双酶切鉴定均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与Genebank序列完全一致。质粒转染293T细胞后绿色荧光蛋白表达量和上清中HGF蛋白含量随时间增长而增多,72h最高。24h、48h、72h后HGF蛋白含量分别为(477±19),(1424±78),(4274±128)μg/L。测得病毒的滴度为1.9×108TU/mL。结论携带hHGF基因的慢病毒载体构建成功,在293T细胞中正确表达,并获得较高的病毒滴度,为其体内外研究提供基础。