整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM）和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts, PEF)转录组比较分析，在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子（OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5）的前期研究基础上，尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体，并与pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞，以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系，为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate，DOX)激活转录因子表达，高效诱导形成猪诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）的相关研究奠定基础。方法：以PEF细胞cDNA为模板，利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子，并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段（RLD），最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体pTRE3G-Zs中，获得3个重组表达载体；利用核转染的方法，将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞，并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果：扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1（975bp）、LIN28（727bp）和DPPA5（408bp），并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD，最终构建了3个表达载体（pTRE3G-Zs-OCT4、pTRE3G-Zs-TBX3、pTRE3G-Zs-RLD），且经酶切鉴定证明载体连接正确；3个表达载体与pEF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后，经过药物筛选和外源基因鉴定，共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个，其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论：成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。

Establishment of transgenic porcine fetal fibroblast cell lines with multi-copy of porcine transcriptional factors