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整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立
引用本文:张曼玲,陈 袁,赵丽华,李艳如,金 永,王俊政,姜海滨,陈俏羽,李荣凤. 整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2017, 0(11): 1377-1384
作者姓名:张曼玲  陈 袁  赵丽华  李艳如  金 永  王俊政  姜海滨  陈俏羽  李荣凤
作者单位:南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166,南京医科大学江苏省异种移植重点实验室,江苏 南京 211166
基金项目:国家自然科学基金(31371487)
摘    要:目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass, ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts, PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞cDNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体pTRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(pTRE3G-Zs-OCT4、pTRE3G-Zs-TBX3、pTRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与pEF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。

关 键 词:猪转录因子;2A肽基因序列;诱导表达载体;转基因细胞系;iPS细胞
收稿时间:2017-07-04

Establishment of transgenic porcine fetal fibroblast cell lines with multi-copy of porcine transcriptional factors
Zhang Manling,Chen Yuan,Zhao Lihu,Li Yanru,Jin Yong,Wang Junzheng,Jiang Haibin,Chen Qiaoyu and Li Rongfeng. Establishment of transgenic porcine fetal fibroblast cell lines with multi-copy of porcine transcriptional factors[J]. Acta Universitatis Medicinalis Nanjing, 2017, 0(11): 1377-1384
Authors:Zhang Manling  Chen Yuan  Zhao Lihu  Li Yanru  Jin Yong  Wang Junzheng  Jiang Haibin  Chen Qiaoyu  Li Rongfeng
Affiliation:Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China,Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China and Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, NJMU, Nanjing 211166, China
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