CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的：利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证，其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系，为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法：选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点，分别设计并合成单导向RNA（single guide RNA，sgRNA），将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒，分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4；用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后，将高效打靶载体与含G418抗性的质粒（pCMV?tdTomato）共转染原代猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs）中，并通过药物筛选获得单克隆细胞群落，随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果：分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后，利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个，其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体，经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系，其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系，为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础，并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。