利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast，PFF)细胞系，为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型(se- vere acute respiratory syndrome coronavirus type 2，SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法：①利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对，将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基，设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。②设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA，克隆到pX330载体上构建ACE2基因打靶载体。③将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞，筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果：根据氨基酸序列比对结果，将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基，设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系，为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。