血管紧张素II-1型受体自身抗体直接抑制人肾上腺皮质细胞分泌醛固酮的机制探讨

【立论依据】 子痫前期是妊娠期特发疾病,醛固酮(ALD)水平下降引起的血容量及胎盘灌注不足是子痫前期孕妇病情恶化的主要原因,但ALD下降的原因及机制不清。研究发现,子痫前期孕妇体内存在高滴度的血管紧张素II(AngII)1型受体(AT1R)自身抗体(AT1-AA)。AT1-AA可专一识别激活AT1R细胞外第二环表位(AT1R-ECII)肽段,发挥类内源性AngII样作用。本实验室前期发现,AT1-AA与子痫前期患者体内ALD呈负相关,且AT1-AA可使怀孕及未孕的大鼠血清ALD水平降低。提示AT1-AA可能通过某种直接或间接机制影响了肾上腺皮质细胞分泌ALD的功能。 【设计思路】 为排除其他因素对ALD分泌的影响,本研究拟通过离体实验探究AT1-AA是否可直接作用于肾上腺皮质细胞,干扰ALD分泌;如果是,进一步探究参与ALD分泌异常的关键酶及信号通路。 【实验内容】 将子痫前期患者血清中提纯的AT1-AA、提纯患者血清中AT1-AA后剩余的IgGs(nsIgG)、正常孕妇血清中提纯的IgGs(ngIgG)、AngII、AT1-AA+AT1R阻断剂氯沙坦、氯沙坦,分别作用于人肾上腺皮质球状带H295R细胞。不同时间点(6、12、24、48、72 h)后用放射免疫法检测细胞上清液中ALD的分泌量。预实验结果显示,AT1-AA作用于H295R细胞12 h后上清中ALD含量下降,符合预期;然后用蛋白质印迹、RT-PCR、荧光分光光度法分别检测合成ALD的两种限速酶——StAR与CYP11B2的含量、转录、活性的变化;用蛋白质印迹法检测介导ALD合成的经典信号通路AT1R-PLC-PIP2-PKC以及经血管内皮生长因子受体交联激活的Ras-Raf-MEK-MAPK通路中重要信号蛋白的变化,并用阻断剂及siRNA技术对发生变化的关键信号蛋白的作用进行验证。 【材料】 H295R细胞株;DMEM/F12培养基;氯沙坦;PKC等信号蛋白单抗等。 【可行性】 理论上,已证实AT1-AA在体内与ALD的水平呈负相关,且肾上腺皮质细胞表面表达AT1R,因此有AT1-AA直接作用于肾上腺皮质细胞并干扰ALD合成的可能性。本实验室有支持蛋白质印迹、RT-PCR等实验相关设备,实验组成员也已掌握相关实验技术。 【创新性】 原创性地探究AT1-AA直接作用于肾上腺皮质细胞,抑制其分泌ALD的能力及其具体信号通路。同时证实AT1-AA除发挥类AT1R激动剂作用外,在某些病理情况下,也可能发挥与AngII相反的作用。