疟疾蚊媒监测多重PCR方法的建立

目的 建立疟疾消除后高效的蚊媒监测多重PCR方法。方法 设计疟原虫属、人血、中华按蚊和蚊通用4对特异性引物，与通用引物（5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′）连接后，形成4对嵌合特异性引物。常规PCR确定各引物对的最佳退火温度和引物工作浓度，多重PCR优化4对引物混合后的最佳反应条件，引入模拟风险感染阳性蚊虫样品，建立敏感的多重PCR反应体系。检测4种疟疾（间日疟、卵形疟、恶性疟、三日疟）患者全血样品的原虫密度梯度稀释样品的各基因扩增情况，评估检测灵敏度。用溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、日本血吸虫尾蚴、卫氏并殖吸虫、蛔虫、牛带绦虫、猪带绦虫等11种其他寄生虫虫体DNA或感染样品评价该方法的检测特异性。用畜圈周围采集的野生中华按蚊样品，评价所建PCR方法的应用效果。结果优化后的多重PCR反应体系各组分含量（体积比）为：DNA模板10%、引物Mix10%、三蒸水30%, Taq酶预混液50%。引物Mix中，蚊通用、按蚊、人血和疟原虫引物的用量配比为1∶1.75∶3∶5。反应体系的最佳循环条件为：95℃5 min; 94℃...