cblC型甲基丙二酸血症MMACHC基因新突变对小鼠神经细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的作用机制

目的探讨cblC型甲基丙二酸血症(MMA)致病基因MMACHC新突变,对小鼠神经细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的作用机制。方法选择2017年5月和7月,江苏省新生儿疾病筛查中心徐州分中心筛查确诊2例cblC型MMA患儿的血液样本中,检出的c.626_627del及c.228_231del 2种MMACHC基因新错义突变为研究材料。分析MMACHC基因的2种新突变所累及的氨基酸残基的保守性及预测其致病性后,构建MMACHC基因2种新突变重组质粒,并与野生型MMACHC基因重组质粒,分别瞬时转染小鼠神经细胞(神经元细胞株HT22及神经干细胞株C17.2)进行体外实验。将MMACHC基因c.626_627del质粒转染的小鼠HT22、C17.2细胞,分别纳入神经元观察1组、神经干观察1组;将MMACHC基因c.228_231del质粒转染的小鼠HT22、C17.2细胞,分别纳入神经元观察2组、神经干观察2组;将野生型MMACHC基因重组质粒转染的小鼠HT22、C17.2细胞,分别纳入神经元对照组、神经干对照组。采用免疫荧光染色、TUNEL荧光检测及蛋白质印迹法(Western blotting)等,分析小鼠神经细胞凋亡情况及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况。采用单因素方差分析及Dunnett t检验,对2个观察组分别与对照组神经细胞的细胞凋亡率,凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平进行统计学比较。本研究经过徐州妇幼保健院伦理委员会批准审批文号:〔2019〕伦审第(09)号]。结果①MMACHC基因2种新突变所在氨基酸位点(第77位及第209位),在人源、家鼠、褐鼠、斑马鱼及猕猴5个物种间高度保守。生物信息学分析显示,2种突变均可能具有致病性。②与对照组相比,与之对应的2个观察组神经细胞的细胞核DAPI染色着色更深(亮蓝色),TUNEL荧光阳性(绿色)细胞数更多。神经元观察1组细胞凋亡率(DAPI染色)及凋亡率(TUNEL染色)分别为(25.8±1.1)%、(23.1±1.4)%,均高于神经元对照组的(4.9±0.9)%、(3.2±0.4)%,并且差异均有统计学意义(t=25.95、24.41,均为P<0.001);与此具有相似结果的是,神经元观察2组与神经元对照组比较,以及神经干观察1组、2组分别与神经干对照组比较,差异亦均有统计学意义(均为P<0.05)。③神经元观察1组、2组HT22细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、cleaved caspase-3及细胞质内β-连环蛋白(β-catenin)表达水平,均分别高于神经元对照组,而Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白突触后致密物(PSD)-95、myc-MMACHC、磷酸化-糖原合成酶激酶(p-GSK)-3β(Ser)及细胞核内β-catenin表达水平,则均分别低于神经元对照组,并且差异均有统计学意义(P<0.05)。④神经干观察1组C17.2细胞中caspase-3、PSD-95、myc-MMACHC、p-GSK-3β(Ser)及细胞核内β-catenin表达水平,均低于神经干对照组,而cleaved caspase-3、GSK-3β及细胞质内β-catenin表达水平,则均高于神经干对照组,并且上述差异均有统计学意义(P<0.05)。神经干观察2组C17.2细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、GSK-3β及细胞质内β-catenin表达水平,均高于神经干对照组,而细胞核内β-catenin表达水平,则低于神经干对照组,并且上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MMACHC基因2种新突变可能通过抑制GSK-3β-Wnt/β-catenin信号通路,而促进小鼠神经细胞凋亡。