L-精氨酸增强人凝血因子Ⅷ基因表达机制的研究

目的:进一步探讨L-精氨酸能够增强人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)基因在体外的表达机制。方法:扩增B结构域缺失的hFⅧcDNA(BDDhFⅧcDNA)的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因,并将其作为启动子,分别插入含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的载体pCAT3-Enhancer的启动子位点,构建成载体pA1-CAT3-Enhancer、pA2-CAT3-Enhancer、pA3-CAT3-Enhancer、pC1-CAT3-Enhancer和pC2-CAT3-Enhancer。再将各载体分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,加入L-精氨酸(终浓度10mmol/L)培养24h。实验设转染阴性对照(不含启动子)、转染阳性对照,各组再设加L-精氨酸及不加L-精氨酸的对照组(共14组)。采用体外细胞核连缀反应(run-onassay)检测CAT基因的转录,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组HUVECs裂解液中CAT蛋白的含量。结果:在无L-精氨酸存在的情况下,转染阴性对照载体pCAT3-Basic、pA3-CAT3-Enhancer、pC1-CAT3-Enhancer和pC2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中均未检测到有CAT基因转录,CAT蛋白含量均为背景值,转染阳性对照载体pCAT3-Control的HUVECs裂解液中CAT基因有强转录,转染pA1-CAT3-Enhancer和pA2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中只能检测到微弱的CAT基因转录,CAT蛋白含量分别为(61.85±7.86)pg/106个细胞和(60.27±7.27)pg/106个细胞。在与L-精氨酸共培养24h后,转染pA2-CAT3-Enhancer的HUVECs裂解液中CAT基因的转录和蛋白表达显著增强,CAT蛋白含量达到(368.56±21.85)pg/106个细胞,显著高于未加L-精氨酸组(P<0.01),而转染其他各载体的HUVECs裂解液中CAT基因转录和表达的变化与未加L-精氨酸组间差异均无统计学意义。结论:hFⅧ的A1和A2结构域基因能作为启动子驱动CAT基因的转录和表达,而L-精氨酸可显著增强hFⅧA2结构域基因启动的CAT基因转录和表达。