人ATG4B的表达及蛋白纯化和鉴定

目的构建含His标签的自噬相关蛋白4同源物B(ATG4B)重组质粒以得到His-ATG4B蛋白,初步鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出ATG4B基因的编码序列,插入p ET-28a(+)载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化Rossate菌,挑选小量诱导出的His-ATG4B菌液进行His-ATG4B蛋白的纯化,SDS-PAGE和Western blot法检测His-ATG4B蛋白的纯化效果,GST pull-down技术对蛋白生物学功能进行鉴定。结果用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到大小约1100 bp的目的片段,插入p ET-28a(+)载体中构建出His-ATG4B重组质粒,酶切鉴定及测序结果均表明His-ATG4B质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化蛋白,得到相对分子质量(Mr)约为47 000的His-ATG4B蛋白,且SDS-PAGE检测蛋白纯化效果较好;GST pull-down实验证实His-ATG4B蛋白可以和LC3B蛋白在体外相互作用,生物学活性良好。结论本实验成功得到His-ATG4B蛋白,为研究ATG4B在自噬中的作用机制奠定实验基础。