鼠角膜缘干细胞3D共培养模型的建立及生存率、表型维持

目的 探讨纤维蛋白凝胶、鼠胚胎成纤维细胞与鼠角膜缘干细胞的3D共培养模型是否有助于角膜缘干细胞的生存率提高和细胞表型的维持.方法 细胞采用96孔圆底培养板培养,并分为3组:①鼠角膜缘干细胞单独培养组(A组),含3×104个角膜缘干细胞;(2)鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白共培养组(B组),将纤维蛋白原配成10 mg/mL的磷酸盐溶液,与鼠角膜缘干细胞混合成3×105/mL的混合悬液,取100 μL 细胞悬液培养;③鼠角膜缘干细胞、纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞共培养组(C组),将鼠角膜缘干细胞与鼠胚胎成纤维细胞以1:0.5混合,配成含有10 mg/mL纤维蛋白原的4.5×105/mL混合悬液,取100 μL 进行培养.于培养后4、24和48 h,以Annexin Ⅴ染色,采用流式细胞仪检测其细胞生存率和凋亡率.以Western blot检测角膜缘干细胞分化蛋白Keratin K3/K76的表达.结果 角膜缘干细胞在4、24 和48 h的生存率最高者为C组,分别是(95.7±2.0)%、(95.1±1.2)% 和(92.0±1.7)%;其次为B组,分别是(95.2±3.0)%、(89.8±1.5)% 和(80.0±0.8)%;最低为A组,分别是(95.0±1.2)%,(84.5±1.2)% 和(70.0±0.9)%.细胞凋亡率的趋势与此相反.角膜干细胞分化蛋白的表达强度,在4 h时各组之间的表达强度无统计学差异,但在48 h时,C组的表达强度(70±4)明显低于B组(97±6)和A组(102±4).结论 鼠角膜缘干细胞与纤维蛋白和鼠胚胎成纤维细胞的共同培养模式有助于提高角膜缘干细胞在3D培养中的存活率,可减少鼠角膜缘干细胞的分化和有益于其表型的维持.

Co-culture of Mouse Embryonic Fibroblasts and Fibrin with Corneal Limbal Stem Cells for Viability and Phenotype Maintenance