选择性上调 pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞增殖及 α平滑肌肌动蛋白、纤维酶原激活物抑制剂?1和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的观察选择性上调 pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞(LX?2)增殖及 α平滑肌肌动蛋白(α?SMA)、纤维酶原激活物抑制剂 ?1(PAI?1)和 Ⅰ型胶原蛋白(Collagen?Ⅰ)表达的影响。以进一步探究 pSmad 3C/3L在肝纤维化进展中的作用机制。方法采用脂质体转染的技术(FuGENE? HD)向 LX?2细胞转染野生型 Smad3基因(Smad3 WT)、 Smad3连接区磷酸化位点突变的基因(Smad3 EPSM)及 Smad3 C末端磷酸化位点突变的基因(Smad3 3S?A)3种质粒,选择性上调 LX?2细胞中 pSmad 3C/3L的表达水平,以蛋白质印迹法(Western Blot)验证转染效率并检测 LX?2细胞中 α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ的蛋白表达水平。 MTT法检测选择性上调 pSmad 3C/3L对 LX?2细胞增殖能力的影响。结果转化生长因子 ?β1与 LX?2对照组相(TGF?β1)刺激 1h后,比,转染 3种质粒组 Smad3蛋白表达水平均升高［(0.48±0.02)(0.57±0.03)(0.60±0.02),(0.59±0.03); P＜0.05］;与 Smad3 WT组相比,转染 Smad3 EPSM质粒组 pSmad3C蛋白表达水平明显,升高［(0.33±0,.02)比(0.44±0.01)P＜0.05］,转染 Smad3 3S? A质粒组 pSmad3L蛋白表达水平明显升高［(0.36±0.01)比(0.42±0.02),P＜0.05］。 MTT结果显示,转染,Smad3 EPSM质粒可抑制 LX?2细胞增殖,而转染 Smad3 3S?A质粒可促进 LX?2细胞的增殖［吸光度值(0.48±0.03)比(0.93±0.05)P＜0.05］。 TGF?β1刺激 12 h后, α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ在 3种质粒转染组中呈现出差异表达(P＜0.05)。结论转染 3种质,粒成功地选择性上调了 LX?2细胞中 pSmad 3C/3L的表达,选择性高表达 pSmad3L可进一步促进 TGF?β1诱导的细胞增殖反应、促进 α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ的表达,选择性高表达 pSmad3C可抑制细胞增殖反应、降低 α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ的表达;提示 TGF?β1诱导的 Smad3不同位点磷酸化在 LX?2细胞增殖和 α?SMA,PAI?1,Collagen?Ⅰ蛋白表达的调控中发挥重要作用,为肝纤维化的逆转提供了新思路。