CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术，构建基质 Gla蛋白(MGP)基因敲除的 RAW264.7巨噬细胞系，明确 MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出 3个针对 MGP基因外显子区的单链向导 RNA(gRNA)人工合成 gRNA寡核苷酸序列，并将其插入线性化的 LentiCRISPRv2质粒中，构建成 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒。将重组，质粒与 psPAX2、VSVG包装质粒一同转染 293?T细胞，包装并收集重组慢病毒，将其感染 RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定 RAW264.7细胞系，实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证 MGP mRNA及蛋白表达水平。 qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒，成功包装了含有 MGP?gRNA的重组慢病毒，筛选得到了稳定低表达 MGP的 RAW264.7细胞系。 qPCR及蛋白质印迹法检测显示，MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P＜0.05)。 qPCR结果显示，最具有代表性的 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA1细胞破骨标志分其子 Itgb3(2.29±0.17)、 Acp5(2.86±0.15)、 Ctsk(2.07±0.13)的 mRNA水平均显著上调(P＜0.05)。结论利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了 MGP基因敲除的 RAW264.7细胞系，敲除 MGP后 RAW264.7细胞破骨分化能力增强。