化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

背景：研究显示干细胞有随环境发生分化即“环境依赖性分化”的特性，但骨髓间充质干细胞在心肌组织是否存在此种特性目前尚未形成公识。目的：观察化学诱导剂和模拟的生物微环境诱导对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。设计、时间及地点：随机分组设计，细胞学体外对比观察，于2008-01/2009-02在苏州大学心血管内科干细胞移植实验室完成。材料：6~8周龄SD大鼠，用于骨髓间充质干细胞的培养；新生1~3 d同种系SD大鼠，用于心肌细胞的培养。方法：取SD大鼠股骨骨髓，培养至第2代，经流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度97%以上，制成4×108 L-1的细胞悬液，实验分为4组：单纯DMEM培养组：用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养；5-氮杂胞苷组：24 h后培养液内加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷；心肌细胞裂解液组：将4倍于骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞裂解液加入骨髓间充质干细胞培养瓶中；间接接触组：在培养体系中放入millicell插入式细胞培养皿，28 d收获细胞。主要观察指标：免疫组织化学法检测诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、CD31的情况；RT-PCR法检测各组早期心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、β-肌球蛋白重链及α-肌球蛋白重链基因的表达情况。结果：免疫组织化学检测显示实验组诱导4周后特异性抗原呈阳性表达，实验组与单纯DMEM培养组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)；间接接触组较心肌细胞裂解液组阳性细胞数目稍增多，但组间差异无显著性意义(P > 0.05)；CD31是血管内皮细胞的表面抗原标志，单纯DMEM培养组和5-氮杂胞苷组无表达，其他两组弱阳性表达，组间差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组诱导4周后，均表达心肌前体细胞特异性转录因子NKX-2.5和GATA4，同时表达胚胎期占优势的心肌细胞特异性β-肌球蛋白重链，而没有表达成年期占优势的心肌细胞特异性标志α-肌球蛋白重链。结论：5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，心肌细胞裂解液和细胞间接接触模拟的心肌微环境也可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞，分化的细胞介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体。

Effect of 5-azacytidine and simulated biological microenvironment on differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial-like cells