帕金森病相关基因重组型14-3-3蛋白与多巴胺代谢

目的：制备并分析帕金森病相关基因重组型14-3-3蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响以及对多巴胺代谢的影响。方法：实验于2004-05／12在首都医科大学宣武医院北京老年医学研究所神经生物学研究室进行。取Balb／c雌性小鼠1只．麻醉下取大脑组织并提取总RNA；设计含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，采用反转录一聚合酶链反应法从小鼠脑总RNA中分别克隆编码14-3．31和14-3-3ε的cDNA，并将其分别亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌BL21，以异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导．使其表达融合蛋白谷胱甘肽巯基转移酶-14331和谷胱甘肽巯基转移酶-1433ε。用凝血酶切断融合蛋白，再用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲和层析纯化14．3．31和14．3．3ε。将制备的基因重组型14-3-3蛋白添加至酪氨酸羟化酶的反应体系，用高效液相色谱观察酪氩酸羟化酶的活性变化，结果：克隆的两个cDNA片段长度分别为744bp和768bp，编码247和255个氨基酸，与GeneBank中NM-018871和NM-009536展示的cDNA序列编码区结构一致。重组质粒pGEX-1433γ和pGEX-1433ε在原核细胞表达的融合蛋白质量占细菌可溶性蛋白质组分的5％，纯化的14．3．31和14-3-3ε在SDS-PAGE上表现为单一条带，表观分子质量分别为30ku和32ku。目的蛋白质不影响酪氨酸羟化酶活性，但使磷酸化修饰的酶活性增加约20％。结论：制备了两种基因重组型小鼠14-3-3蛋白，发现两种14-3-3蛋白γ和ε几乎不影响酪氨酸羟化酶活性，但是它们可使磷酸化修饰的酪氨酸羟化酶活性增高，提示14-3-3蛋白通过与磷酸化的酪氨酸羟化酶相互作用来参与多巴胺代谢。