摘 要: | 目的:利用杆状病毒表达系统在体外表达抑癌蛋白P16,为研究P16蛋白的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定基础。方法:(1)利用定向克隆的方法将P16全基因序列插入转移载体pSX-IVVI^ X3的EcoRI,SalI位点上,经氨苄青霉素平板初筛,菌落原位杂交、PCR扩增酶切电泳鉴定后,分离含P16的重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16;(2)用昆虫杆状病毒TnNPV-SVI-G感染sf9细胞扩增病毒,用PEG法沉淀病毒、酚/氯仿抽提纯化病毒DNA;(3)CaCl2沉淀法使重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16和病毒TnNPV-SVI-GDNA共转染sf9细胞,通过多角体观察和PCR法鉴定重组病毒;(4)经空斑纯化法纯化重组病毒,重组病毒感染草地夜蛾细胞(sf9)使P16大量表达,经SDS-PAGE及WesternBlot鉴定所表达的P16蛋白,结果:(1)筛选出两株含P16全基因的重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16;(2)构建了含P16全基因序列的重组杆状病毒TnNPV-p16;(3)SDS-PAGE电泳显示重组病毒TnNPV-P16感染sf9细胞的培养上清及胞体裂解物和阳性对照Hela细胞裂解物在16kD左右均有蛋白条带,而阴性对照TnNPV-SVI-G感染的sf9细胞培养上清中无此蛋白条带,经免疫印迹染色证实此蛋白为抑癌蛋白P16。结论:利用我国自己构建的昆杆状病毒表达系统成功了表达P16蛋白,分子量大小及特异性与国外报道相同。
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