DNA聚合酶-I Klenow片段原位检测缺血性神经元的DNA早期断裂

1　材料和方法 1.1　材料　雄性4 mo龄左右SD大鼠36只，体质量250～350 g, 本校实验动物中心提 供 ；DNA聚合酶-I Klenow大片段、biotin-dATP, dGTP, dCTP, dTTP购自美国Gibco公司. 1.2　脑缺血模型　按文献［1］方法建立前脑缺血模型. 1.3　动物分组及组织切片制备　36只大鼠随机分组，实验组每组4只，假 手术对照组每组2 只，分缺血再灌注1, 2, 3, 6, 24和72 h 6个时间点，各组于相应时间点取脑，将其快速包 埋于干冰中，选择视交叉部位切片，片厚10 μm，储存于-70℃冰箱备用. 1.4　方法　玻片晾干，在40 g.L-1多聚甲醛固定30 min, 0.01 mol.L-1 PB S漂洗5 min×3次；在37℃湿温箱中，用含有10 μmol.L-1的dGTP, dCTP, dTTP标记 的dATP和40 U.mL-1的E.coli Klenow片段及50 mmol.L-1 Tris-HCl, 1 0 mmol.L-1 MgCl2, 50 mmol.L-1 NaCl的混合液(pH 8.0)孵育1 h, 0.01 mol.L-1的PBS液终止反应，然后在PBS/小牛血清白蛋白(0.5 g.L-1)中洗5 m in，再将生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC 1∶300, Sigma)在PBS/小牛血清白 蛋白中孵育1 h，最后用0.5 g.L-1 DAB在PBS (0.01 mol.L-1 pH 7.4)和0.5 g.L-1 H2O2中显色.