脱细胞血管基质与血管平滑肌细胞的体外相容性

目的:酶-化学除垢剂制备脱细胞血管基质,检测其与平滑肌细胞的相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性。方法:实验于2003-12/2005-12在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成。①脱细胞血管基质制备:在37℃水浴振荡条件下,犬总动脉先后用1g/L胰蛋白酶 0.2g/L乙二胺四乙酸钠和1.0%TritonX-100进行脱细胞处理24h和176h,充分漂洗,冷冻干燥后备用。②平滑肌细胞的提取:应用组织块贴壁法体外培养扩增犬隐静脉的平滑肌细胞。③四甲基偶氮唑盐法测定脱细胞血管基质浸提液对平滑肌细胞的毒性:设浸提原液、75%、50%和25%浸提液组,阴性对照组(DMEM 体积分数为0.1的胎牛血清培养液)。以阴性对照组的吸光度作为100%细胞增殖率,增殖百分率(P%)=犤实验组A值/阴性对照组A值犦×100%,按ISO和医学生物材料标准评定材料毒性。④急性毒性试验:取成年大鼠8只,将备用脱细胞血管基质研磨成粉末,生理盐水配成2g/L的混悬液,无菌条件下向大鼠腹腔内注入1mL脱细胞血管基质混悬液,观察72h,记录动物有无死亡及不良反应。⑤亚急性毒性试验:取成年大鼠12只,随机分成2组。实验组用脱细胞血管基质混悬液灌胃,剂量为500mg/kg质量,隔日1次,共10次;对照组给等量生理盐水灌胃。实验期间观察记录体质量变化及动物活动情况。21d取血检查血常规。⑥溶血试验:取抗凝兔血8mL,加入生理盐水10mL,稀释备用。取脱细胞血管基质粉末,加生理盐水中,再加入稀释兔血离心后取上清测定545nm处的吸光度。阴性对照为生理盐水10mL加入稀释兔血;阳性对照为蒸馏水加入稀释兔血。溶血率=犤(试验材料的吸光度-阴性对照的吸光度)/(阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度)犦×100%。⑦凝血试验:血库健康献血员新鲜血浆,用自动血液凝固测定仪进行凝血酶原凝固试验、测定部分凝血活酶凝固时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原。取血浆2mL加入脱细胞血管基质粉100mg,混合后再测定上述指标。结果:①酶-化学除垢剂能使犬总动脉细胞几乎完全脱落,使基质纤维的三维结构变得疏松。苏木精-伊红、胶原染色和弹力纤维染色显示脱细胞血管基质无细胞残留,主要成分为胶原和弹力纤维。②动物实验表明材料无急性、亚急性毒性。体外实验脱细胞血管基质的溶血率为1.6%,符合医用生物材料生物性能测试所提出的溶血率<5%标准。材料混合前后,血浆中凝血酶原凝固试验、部分凝血活酶时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原4项指标检测结果无明显变化,说明材料不引起凝血功能的改变。③四甲基偶氮唑盐显示75%脱细胞血管基质浸提液培养平滑肌细胞1,3和5d后,细胞增殖率均大于95%,材料毒性为0或1级。结论:TritonX-100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质具有良好的生物相容性,能与异体犬平滑肌细胞结合到一起,并在体外生成血管移植物。

Compatibility of acelluarized allogenic matrix and smooth muscle cells in vitro