HSPgp96诱导巨噬细胞呼吸爆发与细胞内外游离钙关系的研究

目的：探讨从小鼠H22肝癌细胞中提纯的热休克蛋白gp96（HSPgp96）对小鼠腹腔巨噬细胞（PEMφ）呼吸爆发的影响及其与细胞内外游离钙的关系。方法：(1)用亲和层析和离子交换层析等方法从小鼠H22肝癌细胞中获得纯化的HSPgp96。(2)用细胞内过氧化物荧光探针H2DCF-DA监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中,单个细胞活性氧（ROS）信号的变化,反映PEMφ内呼吸爆发时的变化过程;用荧光探针Fluo-3/AM监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中,单个细胞内钙离子（［Ca2+］i）信号的变化。(3)使用细胞膜和细胞内钙通道抑制剂及钙离子载体后,再观察HSPgp96作用后ROS信号的变化。结果：(1)加入HSPgp96后PEMφ内Fluo-3荧光强度立即上升,70s时增幅达161.05%±50.99%;当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后110s增幅分别为84.81%±29.52%和46.21%±17.24%。同时阻断胞内外钙作用,HSPgp96这一诱发功能明显被抑制。加入钙离子载体后可见细胞内荧光强度迅速增强,于110s时达156.98%±45.83%,随后迅速下降。(2)小鼠PEMφ受HSPgp96刺激后表征ROS的荧光强度立即上升,620s达基础荧光值的636.78%±82.02%,随后始终维持在高水平。当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后,再加入HSPgp96后细胞内ROS荧光值上升幅度较小。同时阻断了胞内外钙作用后,HSPgp96刺激后ROS荧光值上升没有明显高峰出现。结论：HSPgp96作用于小鼠PEMφ后,促进了细胞外钙内流并使细胞内钙库释钙,这是HSPgp96诱发细胞内活性氧增加的基本机制。