HPV E6通过Rap1信号通路影响宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒E6蛋白（human papillomavirus E6 protein,HPV E6）对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移的影响及潜在分子机制。 方法 基于Illumina Hiseq 4000转录组测序技术检测12例不同程度的宫颈病变组织之间的基因表达特征,筛选与HPV相关的差异基因;利用GO、KEGG Pathway 方法对差异基因进行生物学功能富集分析;Western blotting检测正常宫颈上皮细胞HCerEpic、宫颈癌细胞Hela中Rap、Rap1GAP蛋白表达水平;通过平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验检测其增殖、侵袭及迁移能力;通过sh-E6慢病毒转染下调细胞内HPV E6表达,分为对照组（Hela细胞）、空载组（sh-NON）和sh-E6组（低表达HPV E6）;下调HPV E6表达,采用平板克隆和CCK-8实验分别检测每组细胞增殖能力和细胞活力;Transwell和划痕实验检测细胞侵袭、迁移能力;Western blotting检测各组细胞中E6、Rap1、Rap1GAP、CyclinD1、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达水平。在sh-E6组基础上过表达Rap1,Western blot检测细胞中Rap1通路及相关蛋白的表达水平;平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力。 结果 测序结果显示,与正常宫颈HPV阴性比较,HPV阳性的正常宫颈、CIN 、宫颈癌组织中差异上调表达的基因分别有340、864和1036个;3个数据集寻找共有差异基因共24个。
GO|KEGG 富集分析24个差异表达基因主要富集在Rap1相关信号通路。与HCerEpic细胞相比,Hela细胞内Rap1表达升高,Rap1GAP表达降低（P < 0.01）;其细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强（P < 0.01）;下调HPV E6表达后,与Hela组比较,sh-E6组细胞的增殖、细胞集落形成、侵袭和迁移能力降低（P < 0.001）;Western blotting表明,与Hela组比较,sh-E6组细胞内Rap1、CyclinD1、N-cadherin蛋白表达降低,Rap1GAP和E-cadherin蛋白表达升高（P < 0.001）。与sh-E6组相比,过表达Rap1组（sh-E6/OE Rap1）细胞内Rap1/Rap1GAP、CyclinD1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达被恢复（P < 0.001）,细胞增殖、侵袭迁移能力被恢复（P < 0.01）。 结论 在宫颈癌发展过程中,HPV E6通过激活Rap1信号通路促进宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移。