两种凝血因子Ⅹ新基因突变的异位转录和体外表达研究

目的探讨遗传性凝血因子X（FX）缺陷症的分子发病机制。方法对在一个遗传性凝血因子X（FX）缺陷症家系中发现的两种FX基因新突变剪接位点突变IVS1＋1G〉A和错义突变Arg347His，分别进行异位转录和体外表达的研究，通过逆转录反应结合巢式PCR扩增的方法，检测患者外周血中的FX异位转录产物。针对Arg347His突变，将野生型FXcDNA克隆至真核细胞表达载体，定点突变构建Arg347His突变质粒。然后将野生型质粒和突变体质粒分别转染HEK293细胞，采用一期法检测细胞培养液中的FX活性；采用ELISA检测分别细胞裂解液和细胞培养液中的FX抗原含量。结果对于IVS1＋1G〉A突变，逆转录结合巢式PCR的产物经克隆后测序只检测到了正常的转录本，而没有发现异常转录本，原因可能是由于IVS1＋1G〉A导致了终止密码的提前出现，从而致使异常转录的mRNA在体内很快被降解。对于Arg347His错义突变，真核细胞表达结果发现，Arg347His突变并没有影响FX蛋白的合成分泌，但突变质粒转染的细胞所分泌的FX蛋白促凝活性明显下降。结论异位转录和体外表达的实验进一步证实了IVS1＋1G〉A和Arg347His是导致本家系先证者表现为FX缺陷症的原因。IVS1＋1G〉A突变导致了异常转录的mRNA在体内被很快降解；Arg347His突变显著降低了FX的促凝活性。

Ectopic transcription and in vitro expression studies on two novel mutations causing factor Ⅹ deficiency