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携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定
引用本文:范迟,高下,徐琳,朱光洁,陈杰,麻晓峰,丁小琼,陆玲,周函. 携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定[J]. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(1): 10-13. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2200.2010.01.004
作者姓名:范迟  高下  徐琳  朱光洁  陈杰  麻晓峰  丁小琼  陆玲  周函
作者单位:1. 东南大学医学院, 江苏南京 210009;2. 南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻喉科, 江苏南京 210008
基金项目:江苏省重点人才项目基金资助(RC2007010);;南京市医学科技重点项目基金资助(ZKX06019)
摘    要:目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为109PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。

关 键 词:腺病毒     人神经营养素-3   红色荧光蛋白   耳蜗圆窗
收稿时间:2009-03-23

Construction and identification of recombinant adenovirus with NT-3 gene
FAN Chi,GAO Xia,XU Lin,ZHU Guang-jie,CHEN Jie,MA Xiao-feng,DING Xiao-qiong,LU Ling,ZHOU Han. Construction and identification of recombinant adenovirus with NT-3 gene[J]. Journal of Bengbu Medical College, 2010, 35(1): 10-13. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2200.2010.01.004
Authors:FAN Chi  GAO Xia  XU Lin  ZHU Guang-jie  CHEN Jie  MA Xiao-feng  DING Xiao-qiong  LU Ling  ZHOU Han
Affiliation:1. Medical College, Southeast University, Nanjing Jiangsu 210009;2. Department of Otorhinolaryngology, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing Jiangsu 210008, China
Abstract:Objective:To construct the recombinant adenovirus vector carrying neurotrophin-3(NT-3) gene.Methods:NT-3 and DsRed2(including the ligation region pIRES2) fragment which had been digested by proper enzyme from NT-3-pIRES2-DsRed2 plasmid were cloned into adenovirus pAdShuttle-CMV plasmid.Adenovirus vector pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2 were electroporated into BJ5183 which had been transformed into pAdEasy-1 previously to have the recombination with pAdEasy-1.Recombinant AdEasy plasmid DNA was analyzed and linear...
Keywords:recombinant adenovirus  human  neurotrophin-3  red flurorescence protein  cochlea round window  
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