| 摘 要： | 目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)基因组编辑技术对内源性H1FX进行表位标记来执行染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq),探究前列腺癌22Rv1细胞中H1FX在基因组上的结合位点及分布规律。方法 以质粒pX330-U6-Chimeric＿BB-CBh-hSpCas9为载体,设计特异性向导RNA(gRNA),构建pX330-H1FX重组质粒,引导Cas9核酸酶至接近H1FX终止密码子的位置处进行切割。以含有3×FLAG表位标签、自剪切多肽2A和遗传霉素耐药基因序列的质粒pFETCh＿Donor为载体,序列两侧添加与双链断裂两侧区域同源的同源臂(HOMO),构建pFETCh＿Donor-HOMO重组质粒。将pX330-H1FX重组质粒和pFETCh＿Donor-HOMO重组质粒共转染到前列腺癌22Rv1细胞中,切割DNA并通过同源重组修复的方式整合表位标签。48 h后使用含遗传霉素的培养基筛选细胞。筛选出内源性表位标记的H1FX-FLAG细胞系后使用FLAG抗体进行ChIP。对ChIP富集的DNA和给料对照(Input)DNA进行建库...
|
