应用USE定点诱变技术制备Wilson病突变体

目的]克隆Wilson病(WD)基因的全长cDNA，制备WD的突变体，为进一步研究突变蛋白的功能奠定基础。方法]采用RT-PCR和。FOPO-TA克隆技术，克隆了全长WD cDNA，并以此为膜板应用USE定点诱变技术(特异性位点抹除技术)构建了778位(CGG→CTG)、1069位(GTG→GTC)两个突变体。结果]成功克隆了WD cDNA，并经过全长测序没有发现突变的存在。以此为模板制备了WD基因8号外显子第778位密码子由CGG突变为CTG、14号外显子1069位GTG→GTC的突变体，从而构建了含中国人和欧美WD基因的高频突变点。结论]USE定点诱变技术是寡核苷酸引物诱变技术的一个重大的改进，该技术采用双位点同时突变的方法，经两次酶切，两次转化，选择效率很高。