犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究

目的 检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。 方法 将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme, R酶)插入犬贾第虫病毒（Giardia canis virus, GCV）转染载体中, 构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体： 短反义序列, 上游及下游均为21个碱基, 形成重组质粒KRzS； 长反义序列, 上游为288个碱基, 下游为507个碱基, 形成重组质粒KRzL。 另设两种阴性对照, 即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因, 上游为324个碱基, 下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1 基因的反义片段而无R酶功能区)。应用荧光实时定量RT?鄄PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1 基因mRNA切割活性。 结果 KRzS、 KRzL转录体对KRR1 基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%。而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小, RT-PCR效率仅降低12.0%。TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响。 结论 犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割, 为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据。