使用hTERT启动子实现肿瘤特异性RNA干扰

目的：修饰hTERT核心启动子，构建shRNA表达载体，实现肿瘤特异性RNA干扰。方法：使用人工TATA盒修饰hTERT核心启动子，重建转录起点。将含有修饰后hTERT启动子的MluI／XhoI片段克隆至pGL3-OCP—shLuc的相应酶切位点，获得pGL3-mhTERT—shLuc。设计针对p53的shRNA编码序列，并以XhoI／XbaI克隆至pGL3-mhTERT-shLuc的相应酶切位点之间，获得pGL3-mhTERT—shp53。使用pGL3-mhTERT—shLuc与pGL3-control共转染人骨肉瘤细胞U20S、MG-63和HOS，48h后测定虫荧光素酶活性，计算相对活性。使用pGL3-mhTERT—shp53不同的人骨肉瘤细胞，利用Western Blot分析转染前后p53的表达水平。结果：双酶切鉴定和DNA测序证实pGL3-mhTERT—shLuc和pGL3-mhTERT-shp53的序列与设计完全一致。pGL3-mhTERT—shLuc与pGL3-control共转染实验发现，在hTERT—U20S细胞虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异，而在hTERT 的MG-63和HOS细胞在转染后虫荧光素酶相对活性显著降低，与对照组相比抑制效率可分别达到69．7％和71．0％。Western Blot分析表明，与转染pGL3-mhTERT相比，使用pGL3-mhTERT—shP53转染MG-63和HOS后可显著抑制p53的表达，而U20S的p53的表达水平与对照组没有明显改变。结论：我们成功使用TATA盒对hTERT核心启动子进行了修饰，利用其构建了shRNA表达载体，并实现了肿瘤特异性RNAi，为进一步提高基于RNAi技术的基因治疗方法的安全性奠定了实验基础。

Tumor-specific RNA interference using a modified hTERT promoter