制备人Ⅱ型多巴胺受体cRNA探针检测帕金森病大鼠模型纹状体内Ⅱ型多巴胺受体基因表达的变化

目的：获得单链、杂交结果稳定的人Ⅱ型多巴胺受体基因正义和反义RNA探针，检测人Ⅱ型多巴胺受体在帕金森病大鼠模型中表达的变化。方法：实验于2002-10／2003-06在首都医科大学神经科学研究所内完成。选出2，6，12周帕金森病大鼠模型60只，每组各20只，用来做原位杂交的组织处理；将已制备的pGEM-T-Easy-D2R质粒载体分别经ClaI、Xba I限制性酶切反应得到线形质粒，再分别以17和SP6聚合酶制备了人Ⅱ型多巴胺受体基因的反义和正义探针，通过斑点杂交检测探针的浓度；将反义和正义探针分别作等梯度稀释，分别与组织切片杂交，强度洗脱后，观察使对照正义链探针没有杂交信号，而反义探针杂交后也无本底的最适宜浓度，从而降低内缘性其他多巴胺受体亚型的干扰作用；用制备的最适宜浓度探针分别杂交帕金森病大鼠模型2，6，12周的组织切片，杂交后冲洗，免疫检测及呈色，观察帕金森病大鼠模型纹状体中Ⅱ型多巴胺受体表达。结果：①实验标记的人Ⅱ型多巴胺受体探针属cRNA探针，其特点为单链探针，杂交过程不需变性，可合成最可靠的反义链探针，杂交结果稳定，体外转录合成的cRNA探针长度也比较一致，其浓度分别为150．120mg／L。②将反义和正义探针分别等梯度稀释，分别与组织切片杂交，强度洗脱后，结果证明25mg／L浓度最适宜，对照正义链探针没有杂交信号，而反义探针杂交后也无本底。③原位杂交证实，反义探针能够与帕金森病大鼠模型纹状体中Ⅱ型多巴胺受体mRNA杂交。用反义探针标记的细胞中可见蓝色颗粒沉积，左右半球纹状体中标记细胞数在2周时没有变化，帕金森病大鼠损伤侧和健侧Ⅱ型多巴胺受体mRNA表达没有明显变化；6周时，损伤侧较健侧表达明显上调，12周时，损伤侧与健侧表达都下降且没有明显差别。结论：实验获得了人Ⅱ型多巴胺受体基因反义和正义cRNA探针，并得出无本底的最适宜浓度；制备的人Ⅱ型多巴胺受体cRNA探针可以检测帕金森病大鼠模型纹状体内Ⅱ型多巴胺受体基因变化情况，并说明了帕金森病大鼠纹状体Ⅱ型多巴胺受体mRNA表达水平随模型日期增长而发生相应变化。