TMEM33 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及功能验证

目的:根据microRNA-146a(miR-146a)预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒并进行功能验证,为研究吸入性损伤中miR-146a通过靶向跨膜蛋白33(TMEM33)对Toll样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路的调控作用提供前期的工作基础。方法:通过生物学软件预测TMEM33mRNA 3′端非翻译区(TMEM33mRNA 3′-UTR)可能是miR-146a的作用靶点,将设计合成的TMEM33及其突变序列TMEM33-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒,采用脂质体法将这两种重组荧光素酶报告质粒pMIR-TMEM33和pMIR-TMEM33-mu分别与miR146amimics共转染HEK-293T细胞,以pMIR-TMEM33+miR-control转染HEK-293细胞作对照,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:TargetScan和miRanda软件预测显示,miR-146a与TMEM33mRNA 3′-UTR存在互补结合位点,构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统显示,miR-146a对TMEM33mRNA 3′-UTR具有靶向作用,pMIR-TMEM33+miR146amimics组较pMIR-TMEM33+miR-control组荧光素酶活性降低62%左右,差异具有统计学意义(P<0.01);而miR-146a对TMEM33-mu 3′-UTR无靶向作用,pMIR-TMEM33-mu+miR-146a组与pMIR-TMEM33+miR-control组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建TMEM33mRNA 3′-UTR荧光素酶报告载体,证实miR-146a对TMEM33mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为从基因水平深入揭示吸入性肺损伤发病机制提供实验室数据和方法。