利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞（neural stem cell，NSC）PIN1基因，建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法：取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养；设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA（single guide RNA，sgRNA），以PX330质粒为骨架，构建PIN1的Cas9打靶载体，转染小鼠的成体神经干细胞，通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞；利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平，免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白（Nestin）的表达，Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果：成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体，转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达，免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性，神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达，初步表型分析显示，神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin，并具有向神经元分化的能力。

Establishment of neural stem cells line with PIN1 gene knockout by CRISPR/Cas9