焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的：建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法，为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础。方法：从正常人全血中提取基因组DNA。采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因，克隆构建对照标准品质粒。使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点，双脱氧测序验证。将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序，检测每个点的甲基化程度，制作校正曲线。结果：构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品。经焦磷酸测序检测后，阴性对照标准品甲基化程度为0％，阳性对照标准品甲基化程度为100％，与双脱氧测序结果一致。经对混合样品检测，甲基化频率符合线性关系，线性相关性大于0.99，斜率约为1，并且所有位点的标准偏差约为1％。结论：成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒。建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法。