新mTOR抑制剂洋椿苦素对骨关节炎的保护作用及机制研究

目的：探讨洋椿苦素对骨关节炎的治疗效果及其作用机制。方法：使用软骨细胞系C28/I2作为体外研究对象，采用MTT法检测洋椿苦素的细胞毒性，使用Western blot和免疫荧光检测洋椿苦素对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的抑制作用和对自噬的激活效果；选用C57BL/6J小鼠（n=40）建立右膝骨关节炎模型，同只小鼠的左膝作为正常对照，经腹腔分别给以洋椿苦素（n=20）和生理盐水（n=20）治疗后，利用Western blot、免疫组化、免疫荧光、番红O染色、HE染色、软骨损伤半定量评分系统及炎症分级系统，检测洋椿苦素对mTOR的抑制效果、自噬的激活情况、对软骨的保护和滑膜炎症抑制的效果。结果：①洋椿苦素可抑制C28/I2细胞mTOR的Ser-2448磷酸化位点，同时抑制核糖体S6蛋白激酶磷酸化（ribosomal protein S6，rpS6）的Thr-389和Ser-371位点，其最佳剂量为40 μmol/L（Ser-2448：t=13.42，P=0.000；Thr-389：t=19.06，P=0.000；Ser-371：t=9.52，P=0.000），最佳作用时间为24 h（Ser-2448：t=34.82，P=0.000；Thr-389：t=3.14，P=0.007；Ser-371：t=19.32，P=0.000）；②洋椿苦素可促进C28/I2细胞LC3II/LC3I的比值（t=8.15，P=0.002），并增加自噬小体阳性细胞的数量（t=9.71，P=0.000）；③在骨关节炎中，洋椿苦素可抑制mTOR的磷酸化水平（t=19.03，P=0.005）及rpS6表达阳性的细胞数量（t=27.97，P=0.000），并增加LC3II/LC3I表达水平（t=24.65，P=0.000）和LC3表达阳性的细胞数量（t=33.89，P=0.000）；④洋椿苦素可降低骨关节炎模型中关节软骨的损伤程度（t=8.32，P=0.009），增加软骨细胞的密度（F=3.59，P=0.013），抑制具有I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motifs 5，ADAMTS-5）的表达（F=1.82，P=0.002）；⑤在骨关节炎模型的滑膜组织中，洋椿苦素可通过对白介素-1β（Interleukine-1 beta，IL-1β） 的抑制（F=3.20，P=0.000）从而抑制滑膜组织中的炎症反应（F=5.44，P=0.029）。结论： 洋椿苦素作为一种潜在的mTOR抑制剂，在小鼠模型中可通过激活自噬降低关节软骨的损伤并保护软骨细胞，还可通过对ADAMTS-5和IL-1β的抑制实现对细胞外基质的保护和炎症的抑制，但对骨关节炎中软骨的损伤的保护效果及机制还需进一步研究。

Effect and mechanism of novel mTOR inhibitor cedrelone for osteoarthritis treatment