大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景：细胞干燥保存的研究报道较多，组织器官是否适用于干燥保存，尚缺乏证据。目的：用海藻糖作为干燥保护剂，优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件，探索皮肤干燥保存的可行性。设计、时间及地点：观察性实验，于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成。材料：体质量150 g左右成年SD大鼠。海藻糖由Sigma公司提供。方法：通过控制海藻糖浓度(50，300，500，800，1 000 mmol/L)、负载时间(0.5，4，7，9 h)和温度[4 ℃、4~37 ℃(相转变)和37 ℃]，优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件。将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育，程序冷冻仪以1 ℃/min的速率降温至-80 ℃后移入冷冻干燥机中进行冻干。将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性，并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照。以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构，并进行自体移植。主要观察指标：海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况。冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况。结果：海藻糖浓度小于800 mmol/L，皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P < 0.05)，浓度大于800 mmol/L，海藻糖载入量差异不显著。孵育温度为37 ℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4 ℃组(P < 0.05)，相转变组与37 ℃组差异无统计学意义。皮肤孵育4，7，9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P < 0.05)，孵育时间为4，7，9 h之间的海藻糖载入量差异不显著，但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加。实验以海藻糖浓度为800 mmol/L，孵育温度为37 ℃，孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤。冻干皮肤玻璃化状态良好，呈半透明状。水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽，组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别。冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤 (P < 0.05)。冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠，可存活长达13 d。结论：海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存，海藻糖浓度为800 mmol/L，孵育温度为37 ℃，孵育时间为 7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件。

Freeze-drying preservation of rat skin tissues