小鼠AFPcDNA真核表达载体的构建、表达及体外抗肝癌免疫活性的检测

背景与目的:探索肝癌细胞的突变基因产物——具有潜在抗原性的异常蛋白质而无法形成有效免疫原的机理,寻找肝癌的特异性抗原,并在此基础上研制出治疗肝癌的DNA疫苗将对肝癌的免疫学治疗产生积极的影响。本实验构建BALB/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突细胞(dendriticcells,DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用。方法:采用RT-PCR方法自小鼠肝癌细胞株H22中扩增出具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA,将该基因定向插入真核表达载体PEGF-N3中;同时培养经rmGM-CSF、rmIL-4诱导的小鼠骨髓细胞,体外获取大量DCs,脂质体转染PEGF-N3/AFP1、PEGF-N3/AFP2至DCs进行表达、鉴定。将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,ELISA方法测定脾细胞γ-干扰素(IFN-γ)分泌活性,51Cr释放法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果:从H22中克隆到AFP1cDNA和AFP2cDNA,经测序完全正确,所构建的真核表达质粒PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2在小鼠DCs中获得稳定高效表达,其中PEGF-N3/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)为5.12±1.46,明显高于空质粒组(1.42±0.73)。AFP2/DC疫苗对H22细胞的特异性杀伤活性[(88.15±16.47)%]明显高于空质粒组[(12.72±5.45)%]。结论:成功地构建了真核表达载体PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的PEGF-N3/AFP2转染的DC,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能为诱导肝癌细胞凋亡。

Construction of eukaryotic expression vector of mouse alpha-fetoprotein cDNA and its expression in dendritic cells and in vitro antitumor effect on hepatoma