不明原因复发性流产着床窗口期子宫内膜细胞衰老的分子机制及补肾活血法的干预作用

目的 该研究旨在通过生物信息学、机器学习及动物实验的整合研究策略探究不明原因复发性流产（URSA）着床窗口期（WOI）子宫内膜细胞衰老的分子机制及补肾活血法的干预作用。方法 通过基因表达综合（GEO）数据库平台获取包含健康育龄妇女及URSA患者着床窗口期子宫内膜的微阵列基因集。利用R语言的“limma”包筛选URSA差异表达基因（DEGs）。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）获取与URSA最相关模块基因,并进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。通过人类基因数据库（GeneCards）与在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库获取细胞衰老相关基因集。利用韦恩图在线制图软件筛选“URSA DEGs、最相关模块基因与细胞衰老相关基因”的交集基因。而后利用检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具（STRING）对交集基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析,并通过Cytohubba筛选关键基因。此外,通过最小绝对值选择与收缩算子（LASSO）回归与随机森林算法筛选URSA细胞衰老诊断基因。最后,构建URSA小鼠模型,并随机分为模型组,补肾活血组及阿司匹林组,每组6只;另取6只正常妊娠小鼠作为空白组。补肾活血组给予寿胎丸合当归散配方颗粒药液（12.35 g·kg^-1）灌胃,阿司匹林组以阿司匹林肠溶片（0.011 mL·g^-1）灌胃。空白组、模型组给予等量蒸馏水灌胃。于发现阴道栓的第1天记为妊娠第1天（GD1）开始,连续每日给药,于GD5给药12 h后处死,收集子宫内膜组织样本。利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和免疫荧光检测细胞衰老相关诊断基因在URSA小鼠着床窗口期子宫内膜组织的表达及补肾活血法的干预作用。结果 纳入GSE165004微阵列基因集进行生物信息学分析。根据R语言的“limma”包筛选出URSA DEGs 585个（P<0.05）。WGCNA结果提示品红色模块基因与URSA密切相关（r=0.32,P<0.05）。对品红色模块基因的KEGG分析结果提示,基因主要在细胞衰老、Hippo、NF-κB等信号通路中富集（P<0.05）。此外,通过GeneCards与OMIM网站获取细胞衰老相关基因2 138个;通过韦恩图在线制图工具获得URSA差异表达基因、品红色模块基因与细胞衰老相关基因的交集基因27个,此即URSA着床窗口期子宫内膜组织细胞衰老相关DEGs。PPI分析结果显示核突触蛋白α（SNCA）、血红素加氧酶1（HOMX1）、基质金属蛋白酶1（MMP1）为关键基因。LASSO回归与随机森林共筛选出4个诊断基因,包括凝溶胶蛋白（GSN）、细胞周期蛋白2（CCND2）、RB结合蛋白8（RBBP8）和溶血磷脂酸受体1（LPAR1）。动物实验证实,与空白组比较,模型组GSN的mRNA水平和荧光强度明显升高（P<0.05）,CCND2、RBBP8和LPAR1的mRNA和荧光强度明显减低（P<0.05）。与模型组比较,补肾活血组GSN表达水平明显下降（P<0.05）,CCND2、LPAR1和RBBP8的表达水平明显上升（P<0.05）。结论 URSA着床窗口期子宫内膜细胞衰老与多个基因的调节相关,补肾活血法可作用于多个细胞衰老相关靶点,这可能是其改善URSA子宫内膜容受性的关键机制。