氨基酸组成分析直接鉴定SDS-PAGE分离的蛋白质

蛋白质组学是后基因组时代研究的重要领域。蛋白质组研究的基本技术包括双向凝胶电泳分离技术、蛋白质鉴定技术、计算机图像数据处理与蛋白质组数据库构建等。氨基酸组成分析［1，2］作为蛋白质组研究中的鉴定方法之一，对质谱鉴定、N端氨基酸序列鉴定等具有补充及验证作用。蛋白质是由20种氨基酸通过肽键连接起来的生物大分子，测定蛋白质的氨基酸组成可获得蛋白质的基本信息。本研究以马心肌红蛋白和细胞色素C为样品，优化实验条件，以此建立一种高灵敏度、高准确度的鉴定双向凝胶电泳分离后的蛋白质点方法。该方法还可用于分析天然蛋白质、基因重组蛋白质。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试剂丙烯酰胺、过硫酸胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氟醋酸(TFA)、无水醋酸钠均为国产分析纯；甲叉双丙烯酰胺为进口分装；乙腈、甲醇为色谱纯；邻苯二甲醛（OPA）溶液、氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液、标准氨基酸溶液、硼酸盐缓冲液（pH 10.2）购自Hewlett Packard公司；邻苯二甲醛、马心肌红蛋白、细胞色素C为Sigma公司产品。1.1.2 仪器 Hewlett Packard 1100 HPLC自动氨基酸分析仪；转印仪为Bio-Rad 半干转印仪。1.2 SDS-PAGE电泳 采用15%分离胶，5%浓缩胶；马心肌红蛋白、细胞色素C上样量均为10 μg;聚集电压85 V，1 h；分离电压105 V，3 h；考马斯亮蓝染色。1.3 电转印 转印缓冲液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸,20%甲醇；电转印条件：恒电压24 V，1 h。当凝胶上的蛋白质点转印到PVDF膜时，将PVDF膜用水多次漂洗，晾干，待用。1.4 酸水解 切割PVDF膜上的蛋白质点，放入小玻璃管中，加6 mol/L盐酸400 μl，封口，110℃水解24 h。1.5 氨基酸的提取 将水解后小玻璃管中的样品转移至1 ml样品管中，用氮气吹尽盐酸，并减压抽干。加170 μl提取溶液（水、乙腈和0.1%TFA的比例为50∶100∶20），充分振摇，超声10 min，除去PVDF膜，冷冻干燥。加40 μl硼酸盐缓冲液，混匀，离心，取上清液，浓缩。1.6 氨基酸的测定 采用OPA/FMOC柱前衍生方法。色谱条件：色谱柱C18 ODS-Hypersil,5 μm,125 mm×4 mm；柱温40℃；检测波长338 nm,226 nm；流速1 ml/min，进样量1 μl。流动相A：0.02 mol/L醋酸钠,0.018%三乙胺，0.3%四氢呋喃,用10%醋酸调pH至7.2。流动相B：0.1 mol/L醋酸钠（pH 7.2）∶乙腈∶甲醇（20∶40∶40）。洗脱梯度：0.0 min，0%B；17 min，60%B；18.0 min，100%B；24.0 min，100%B；25.0 min，0%B。1.7 数据库检索 采用Internet上ExPASy蛋白质数据库检索，软件为AACompIdent,选择匹配模型free constellation，按以下各氨基酸之间的摩尔比值输入计算机，Asx,Glx,Ser,Thr,Ala,Pro,Arg,Val,Ilu,Leu,His,Gly,Tyr,Phe。蛋白质酸水解后Cys和Trp几乎被完全破坏，Met,Lys大部分被破坏，因此不输入计算机。Asn和Gln水解后分别为Asp和Glu。