二例Ⅰ型抗凝血酶缺陷症患者反复发生静脉血栓的分子机制研究

目的 对2例Ⅰ型抗凝血酶(AT)缺陷症家系进行表型诊断、基因分析,并探讨其静脉血栓发生的分子机制.方法 常规筛查凝血功能,凝血酶生成试验评估高凝状态.用ELISA法及稀释的蝰蛇毒法分别检测抗心磷脂抗体(ACA)及狼疮抗凝物质(LA).用发色底物法或凝固法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性(PC:A,PS:A及AT:A),用免疫比浊法检测抗凝血酶抗原(AT:Ag).Westem blot方法分析血浆中AT的含量及相对分子质量.用PCR方法扩增AT基因的全部外显子及侧翼序列,用DNA直接测序法进行基因分析,并对静脉血栓相关的基因多态性进行筛查.用定点突变法构建AT Ala404Asp突变体表达质粒,脂质体介导瞬时转染293T细胞,检测细胞上清液和裂解液中AT:Ag.结果 2例先证者的凝血筛查指标均未见异常,凝血酶生成试验显示先证者1的凝血酶生成潜力(ETP)和生成峰值分别为正常人的2.8倍和1.5倍,表明体内呈现明显高凝状态.PC:A、PS:A、ACA及LA检测均未见异常.先证者1、2的AT:A分别为45％和32％,AT:Ag分别为121 mg/L和158 mg/L.血浆Western blot结果显示2例先证者AT含量较正常混合血浆减少,但相对分子质量正常.基因分析发现2例先证者各携带一个杂合突变,分别为g.3291C→T (Thr98Ile)和g.13863C→A(Ala404Asp),未发现静脉血栓相关的基因多态性.体外转染实验结果显示Ala404Asp突变质粒转染细胞的上清液和裂解液中的AT:Ag分别为野生型的4.8％和60.6％.结论 Thr98Ile和Ala404Asp两种AT突变与先证者1、2反复静脉血栓发生明显相关.其中Ala404Asp突变为国际首次报道.其分子发病机制研究显示Ala404Asp突变蛋白存在分泌障碍和细胞内降解增多,导致Ⅰ型AT缺陷症.