细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒

目的：探讨细菌内同源重组两步转化法快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒的方法。方法：将腺病毒骨架质粒pAdEasyl转化BJ5183高效感受态，制备pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态，将线性化的腺病毒穿梭质粒pAdtrack—CMV转化至含pAdEasy—1的BJ5183感受态，筛选获得重组腺病毒载体pAdEazy—CMV。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞，包装、扩增出重组腺病毒RAdCMV，氯化铯梯度离心法进行纯化，采用电镜负染鉴定重组腺病毒，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的蘑组腺病毒感染HeLa细胞，测定转染效率。结果：成功构建了重组腺病毒载体pAdEazyCMV，透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功，并且具有感染力，病毒的滴度呵达2．0×10^10pfu／ml。结论：细菌内同源重组两步转化法可以快速构建重组腺病毒质粒，为后续构建携带不同目的基因的重组腺病毒奠定基础。

High efficient generation of recombinant adenovirus by bacterial intermolecular homologous recombination