大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景:细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据.目的:用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成.材料:体质量150 g左右成年SD大鼠.海藻糖由Sigma公司提供.方法:通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4℃、4～37℃(相转变)和37℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件.将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1℃/min的速率降温至-80℃后移入冷冻干燥机中进行冻干.将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照.以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植.主要观察指标:海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况.冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况.结果:海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P<0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著.孵育温度为37℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4℃组(P<0.05),相转变组与37℃组差异无统计学意义.皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P<0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加.实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤.冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状.水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别.冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤(P<0.05).冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d.结论:海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件.

Freeze-drying preservation of rat skin tissues