人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritIIKS-hKLK1,将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建成重组穿梭质粒,将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1,3Cre共转染293A细胞,经包装并获得重组腺病毒,用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定,测定病毒滴度;用重组腺病毒感染VSMCs,用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率,用RT－PCR和Westernblotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP,其滴度为4.5×1011/L。重组腺病毒感染VSMCs后,在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达,感染率高达90％以上,可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达,并与感染时间(1d-7d)有显著依赖关系,峰值感染复数为100MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP;感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达,该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。