酸环境对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响

目的:观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学特征的影响,探讨椎间盘退变的可能机制。方法:用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘(Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级)髓核组织中分离细胞,体外培养,传代并观察细胞形态。取P2代细胞,利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原(HLA)-DR表达情况进行检测;用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞,2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色,观察其成脂、成骨、成软骨能力。按照国际干细胞治疗协会(ISCT)有关间充质干细胞(MSCs)的判定标准,对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用不同p H值(6.2、6.5、6.8、7.1、7.4)的DMEM10%血清培养液培养P2代细胞,1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖活力(OD值),培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率,不同p H值培养基培养28d时采用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的m RNA表达情况。结果:P0代细胞均贴壁生长。P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96%、95%、94%以上,低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4%)。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。按照ISCT有关MSCs的判定标准,分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义(P0.05);5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义(P0.05),且p H值越低细胞的OD值越小。p H值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组,各组间有统计学差异(P0.05)。p H值7.4组"干性维持"基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的m RNA均明显高于p H值7.1、6.8、6.5、6.2组(P0.05)。随着培养液p H值降低,细胞的凋亡率升高,细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的m RNA表达降低。结论:低p H值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响,培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达,促进细胞凋亡,且随着p H降低作用越明显。

Effect on biological characteristics of human beings nucleus pulposus mesenchymal stem cell under different acid condition