miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响

目的：构建miRNAlet-7a1真核表达载体,研究其在肺癌A549细胞株的表达及对A549细胞增殖的影响。方法：以人肺癌细胞A549的总RNA为模板,RT-PCR扩增miRNApre-let-7a1基因序列,将miRNApre-let-7a1基因克隆到真核表达载体pSilencerTM4.1-CMVneo中,构建成pSilencerTM4.1-let-7a1重组体。将pSilencerTM4.1-let-7a1表达载体瞬时转染肺癌A549细胞,RT-PCR法检测miRNAlet-7a1在转录水平的表达。根据miRBaseTargets数据库,查hsa-let-7a1靶序列,构建let-7a1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-report-let-7a1T,与pSilencerTM4.1-let-7a1表达载体共转染A549细胞,通过荧光素酶活性检测pSilencerTM4.1-let-7a1质粒对其靶序列的作用。MTT法检测pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,对细胞增殖的影响。结果：pSilencerTM4.1-let-7a1真核表达栽体和let-7a1靶序列-报道基因融合质粒经酶切及测序鉴定正确。pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,经RT-PCR证明能有效表达miRNAlet-7a1。pSilencerTM4.1-let-7a1质粒和pMIR-report-let-7a1T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测,相对荧光素酶活性明显降低,表明pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,可表达let-7a1并具有生物学活性。MTT检测结果显示：pSilencerTM4.1-let-7a1转染后的A549活细胞数目明显减少。结论：成功构建了真核表达载体pSilencerTM4.1-let-7a1,转染肺腺癌A549细胞后能有效表达,miRNAlet-7a1基因过表达抑制A549细胞的增殖。