TAR DNA结合蛋白43与泛素体外共相分离机制初步研究

目的 探究TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)与泛素共相分离的动态变化特征及机制。方法 构建TDP-43全长及各结构域原核表达质粒，纯化泛素和TDP-43全长及各结构域截短体蛋白，构建泛素和TDP-43体外的相分离体系，利用荧光显微镜观测通过液-液相分离形成的液滴的动态特征。将泛素和TDP-43真核表达质粒转染入HEK293T细胞内表达，利用荧光显微镜观察TDP-43与泛素形成聚集体并通过pull-down实验检测TDP-43泛素化修饰。结果 成功纯化得到泛素和TDP-43全长及各结构域截短体蛋白。体外相分离体系中发现TDP-43全长和CTD截短体蛋白能够与泛素发生共相分离，且延长孵育时间液滴最终变成流动性较差的聚集体。在细胞内共转染泛素和TDP-43质粒，二者形成不可溶的聚集体，应激条件下TDP-43能够被泛素化修饰。结论 TDP-43能够与泛素蛋白发生共相分离，主要通过TDP-43的CTD结构域与泛素间的多价相互作用驱动，且该凝聚体液滴易形成流动性差的聚集体。在应激条件下，当细胞内蛋白稳态失衡时，TDP-43与泛素被募集到一起形成聚集体且聚集体内的TDP-43会被泛素化修饰。...