Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响

【摘要】 目的：探讨Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢（H2O2）诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响。方法：分离新生（24h内）SD大鼠脊髓，经消化、离心后重悬沉淀，差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中，经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性，确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组：空白组，细胞不予任何处理，正常培养；转染对照组，细胞转染阴性对照siRNA（si-NC）；转染组，细胞转染Mettl3 siRNA（si-Mettl3）；诱导组，细胞采用300μmol/L的H2O2处理；转染对照诱导组，细胞先转染si-NC，然后采用300μmol/L H2O2处理；转染诱导组，细胞先转染si-Mettl3，然后采用300μmol/L H2O2处理。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平，Western blot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平，免疫荧光检测Mettl3表达，酶标仪检测各组整体m6A水平，并检测白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：与空白组相比，诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高（P<0.05），Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），IL-1β（73.39±8.82ng/L vs 125.58±15.31ng/L）、IL-6（63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L）、TNF-α（103.29±12.19ng/L vs 204.37±23.65ng/L）和MDA（4.01±0.67pmol/L vs 9.23±1.05pmol/L）水平显著性升高（P<0.05），SOD（28.37±3.72U/mg vs 17.23±2.05U/mg）和GSH-Px（158.19±19.26U/mg vs 83.35±9.05U/mg）水平显著性降低（P<0.05），且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），细胞凋亡率显著升高（8.30±0.68）% vs （34.29±3.16）%，P<0.05]；与诱导组相比，转染诱导组的m6A甲基化修饰水平显著性降低（P<0.05），Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），IL-1β（125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L）、IL-6（101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L）、TNF-α（204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L）和MDA（9.23±1.05pmol/L vs 7.28±0.96pmol/L）水平显著性降低（P<0.05），SOD（17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg）和GSH-Px（83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg）水平显著升高（P<0.05），且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性下调（P<0.05），Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调（P<0.05），细胞凋亡率显著性降低（34.29±3.16）% vs （23.57±2.01）%，P<0.05]。与空白组相比，转染组的炎性因子、氧化应激和凋亡水平均无显著性差异（P>0.05）。结论：H2O2可上调脊髓神经元中m6A甲基化修饰水平，并可诱导氧化应激和细胞凋亡；抑制Mettl3表达能够降低H2O2诱导的脊髓神经元m6A甲基化修饰水平，进而缓解氧化应激和细胞凋亡。

Effects of Mettl3-mediated m6A methylation modification on oxidative stress and apoptosis induced by hydrogen peroxide in spinal cord neurons