慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的 探讨以慢病毒(Lentivirus,LV)为载体,转染绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因至神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的方法,观察其转染效率.方法 应用包装细胞293T将三种质粒载体pGC-E1-GFP、pHelper1.0 和pHelper2.0经脂质体转染重组,构建成表达GFP的慢病毒载体(Lentiviral vector-GFP,LV-GFP).并从孕14天大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞,采用无血清培养法,进行体外培养、扩增.取经过5次传代神经干细胞,以1×105个细胞/500μl/孔接种于24孔板,分别按复感染指数(Multiplicities of infection,MOIs值)为0、1、5、10、15、20加入LV-GFP稀释液100μl,每一滴度加六孔,共六组.48～72小时后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率,并在72小时后进行神经干细胞球进行计数,以观LV-GFP对NSCs增殖的影响.并行流式细胞仪检测,得出各组NSCs的 GFP阳性转染率.结果 除MOI值为0的对照组外,48～72小时后各孔均有GFP表达.MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P<0.05),MOI值为10的组能获得>90%的转染率.但MOI值从10增至20,形成的神经干细胞球数目却逐渐减少(P<0.05).结论 LV是将目的 基因转入NSCs的理想载体.以MOI为10的滴度,LV可将GFP基因高效转入神经干细胞内并表达.