冻干重组人三突变型HIF-1α腺病毒生物学效应考察

目的研究冻干对重组人三突变型HIF-1α腺病毒(Ad-HIF-1α-564/402/803)生物学效应的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率,在适宜的条件下制成冻干剂。采用MTS试剂盒观察冻干前后Ad-HIF-1α-564/402/803对hMVECs增殖的影响。分别在冻干前、冻干后1 d、6月、12月四个时间点提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定重组人三突变型HIF-1α腺病毒基因;并在4个时间点以Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs,提取蛋白进行western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果 X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定。冻干前后重组人三突变型HIF-1α腺病毒对hMVECs增殖影响无显著差异(P>0.05)。经PCR及基因测序鉴定,在四个时间点,腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或突变,HIF-1α蛋白表达无差异(P>0.05)。结论冻干能够长期保持重组人三突变型HIF-1α腺病毒的高生物活性。