人重组蛋白nm23-H1突变体原核表达纯化与鉴定

目的:构建nm23-H1的S120G,S120G-P96S及S44A突变体原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:通过PCR方法扩增突变型nm23-H1目的片段,利用基因重组技术构建pET28a-nm23-H1突变型原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,鉴定正确克隆转化BL21（DE3）溶源菌,进行蛋白表达及可溶性分析,同时采用NI-NTA镍柱亲和层析法进行纯化,应用Westernblot方法对纯化后蛋白进行鉴定检测。结果:通过酶切和测序鉴定,pET28a-nm23-H1突变型原核表达载体序列正确,编码框正确。转化溶源菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高;其中,S44A为可溶性表达,S120G以可溶性表达为主,少部分为包涵体表达,而S120G-P96S则大部分为包涵体表达;Westernblot检测结果提示3个突变型nm23-H1蛋白分子量均为20kD,与预计值相符。结论:成功构建nm23-H1的S120G,S120G-P96S及S44A突变体原核表达载体,S120G和S44A蛋白可以用于下一步实验研究,而S120G-P96S突变体则可能不适于下一步研究。