慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。